Dans la plupart des expériences biologiques impliquant la culture cellulaire, une étape cruciale de savoir quels comprend cellules sont vivants et qui sont morts dans votre échantillon. Exclusion Dye est la méthode la plus populaire de la mesure de la viabilité cellulaire. Exclusion de colorant est basée sur la théorie selon laquelle les cellules vivantes comprennent des membranes intactes et les cellules mortes ne sont pas, les cellules mortes ainsi absorber le colorant dans le cytoplasme. Il existe différents colorants et les protocoles et les méthodes que vous choisissez doit être basée sur le coût, la sensibilité, la facilité et la longueur de la procédure. Le bleu trypan est un colorant couramment utilisé pour mesurer la viabilité cellulaire parce que la procédure peut être fait dans cinq à 10 minutes et ne coûte que le montant du réactif colorant.
Obtenir un culot des cellules de mesure vous.
Remettre en suspension le culot cellulaire dans du PBS pour obtenir environ 5 x 105 cellules / ml. PBS est utilisé parce que les mesures de viabilité sont plus précises lorsque les cellules sont dans un protéines sériques environnement- sans sérum peut également tacher et vous donner des résultats trompeurs.
Ajouter des parties égales de suspension cellulaire dans du PBS à parts égales de 0,4% du colorant bleu trypan pour obtenir une dilution de 1 à 2 (exemple: 100 ul de cellules à 100 pi de bleu trypan) et mélanger par pipetage de haut en bas.
Incuber le mélange pendant moins de trois minutes à la température ambiante. Si les cellules sont comptées après environ cinq minutes, la viabilité sera inexacte en raison de la mort cellulaire.
Avec la lamelle déjà en place, remplissez chaque côté d'un compteur de hémacytomètre avec la suspension de cellules. Typiquement, chaque côté prendra 10 à 20 ul.
Placez le hémacytomètre sur la scène d'un microscope optique et de se concentrer sur les cellules.
Chaque côté de la hémacytomètre contient plusieurs places. Comptez le nombre total de cellules dans un carré de l'hématimètre. Ensuite, compter le nombre de non-viables (bleu) et les cellules viables (effacer) séparément, sur la même place.
Calculer le pourcentage de cellules viables dans le carré en divisant le nombre de cellules viables par le nombre de cellules totales et en multipliant par 100. Faites ceci pour plusieurs places sur la hémacytomètre pour obtenir une mesure de la viabilité moyenne.