Pour déterminer le fonctionnement d'un gène dans une cellule par transfection d'un gène à surexprimer, il est essentiel de veiller à l'acide (ADN) le clonage et ligature étape désoxyribonucléique impliquant un vecteur approprié est réussie. Si l'étape de ligature n'a pas réussi, ou si insert d'ADN est pas insérée dans le bon sens, les données seront ininterprétable, et il sera impossible de déterminer comment votre gène fonctionne dans la cellule.
Créer réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour votre insert incorporant un site de restriction roman dans l'amorce. Par exemple, votre amorce de PCR est de 18 nucléotides terme à l'amont ou cinq prime (5 ') extrémité ajouter la séquence canonique pour une enzyme de restriction qui ne sont pas déjà dans le plasmide. Cela permettra de clonage unidirectionnel de l'insert dans le plasmide. Les séquences de sites de restriction peuvent être trouvés sur les sites Web de l'entreprise qui vendent les enzymes, telles que les protocoles actuels en biologie moléculaire et la Nouvelle-Angleterre Biolab, qui sont liés dans la section Ressources.
Déterminer la taille des produits PCR. Pour ce faire, exécutez une aliquote du produit de PCR sur un gel d'agarose à 3 pour cent avec un marqueur approprié de poids moléculaire. Cela détermine également si un seul produit a été amplifié.
Séquencer le produit de PCR.
Entrez séquence dans l'outil de recherche d'alignement local de base (BLAST, BLASTN) faire en sorte que seul le gène destiné a été amplifié. L'outil de recherche est liée dans la section Ressources.
Digérer le plasmide ainsi insérer en utilisant les enzymes de restriction appropriées. Pour ce faire, après que le produit PCR a été vérifiée et ligaturé dans le vecteur approprié. Suivez les instructions pour le temps de la digestion et de la température prévue avec les enzymes.
Exécuter une aliquote du plasmide restreint dilué dans du tampon de charge contenant 4x bromure d'éthidium ou un autre agent intercalant de l'ADN pour visualiser l'ADN sur un gel d'agarose. Si l'insert a été correctement ligaturé dans le plasmide, deux fragments doivent être visibles sur le gel.
Séquencer l'insert pour vous assurer qu'il a été incorporé dans l'orientation correcte. Faire en coupant le plasmide ainsi insérer en utilisant des enzymes de restriction qui sont en amont et en aval de l'insert. Conception amorces de séquençage qui intègrent une partie de plasmide et insèrent ensemble dans la même amorce. Cela vous indiquera définitivement sur l'insertion et l'orientation.